Определение активности протеолитических ферментов

Цель работы: ознакомится практически с методом оценки качества ферментных материалов.

Протеолитические ферменты (протеазы) представляют собой одну из наиболее многочисленных групп ферментов. Они имеют большое промышленное значение и широко используются в мясной, молочной, рыбной и других отраслях. Протеазы принадлежат к классу гидролаз, к подклассу пептидгидролаз и катализируют расщепление белков и полипептидов.

В процессе действия ферментов на субстраты характер распада белковых молекул на пептиды и аминокислоты зависит от природы субстрата, свойств фермента и внешних условий (рН, температуры и т.д.). Способность ферментов катализировать расщепление белка до пептидов и аминокислот характеризуется протеолитической активностью, которая выражается числом единиц протеазы в 1г. очищенного препарата или культуры.

Для характеристики ферментных материалов и оценки их качества используются методы, основанные на двух способах определения протеолитической активности (ПАк).

Один из способов предусматривает определять ПАк по скорости ферментативной реакции гидролиза белка (казеина, казеината натрия и гемоглобина), устанавливаемой по общему количеству не осаждаемых трихлоруксусной кислотой продуктов, образующихся за определенный промежуток времени. В другом способе – по количеству образовавшихся аминокислот–тирозина и триптофана. Анализ гидролизатов в первом случае производится интерферометрическим методом, а во втором – колориметрическим с применением реактива Фолина.

Задание: определить протеолитическую активность ферментных препаратов (ФП) колориметрическим методом.

Модифицированный метод Ансона основан на определении скорости ферментативной реакции казеината натрия под действием исследуемых протеолитических ферментов. Скорость реакции определяют по количеству образовавшегося тирозина, которое устанавливают колориметрической реакцией с фенольным реактивом Фолина. В результате образуется комплексное соединение, которое окрашивает раствор в голубой цвет. Интенсивность окраски определяют на фотоэлектроколориметре (ФЭК).

Далее, используя полученные величины оптических плотностей, определяют по калибровочной кривой количество образовавшегося тирозина, которое подставляют в расчетную формулу, и получают ПАк исследуемого ферментного препарата.

Метод рассчитан на определение активности кислых и щелочных бактериальных и грибных протеаз, содержание которых находят при соответствующих значениях рН среды.

ПАк выражается числом единиц протеазы в 1г очищенного препарата или культуры гриба.

За единицу ПАк принимают такое количество фермента, которое за 1 минуту при 30ºС превращает в неосаждаемые трихлоруксусной кислотой продукты гидролиза казеината натрия в количестве, соответствующем 1 мкмоль тирозина (1 мкмоль тирозина составляет 0,181 мг).

Определение активности ферментов, лекция


Читать еще…

Понравилась статья? Поделиться с друзьями: